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本制品为T4 RNA连接酶II截短型(T4 Rnl2tr)，该酶仅包含T4 RNA连接酶II的N端249个氨基酸，可特异性地将5'端预腺苷酰化的DNA或RNA (App-DNA或App-RNA)连接到RNA的3'羟基。

T4 RNA连接酶II截短型(T4 Rnl2tr)与T4 RNA连接酶II(T4 Rnl2)的酶活性完全不同，后者是一种ATP依赖的dsRNA ligase，而前者是一种不依赖于ATP的，依赖于5'端预腺苷酰化的单链核酸连接酶。

T4 RNA连接酶II(截短型)常用于microRNA (miRNA)等3'端为羟基的单链RNA在克隆、高通量测序建库或PCR检测等时，在3'羟基端添加5'端预腺苷酰化的DNA或RNA接头。

T4 Rnl2tr只能利用5'端预腺苷酰化的单链DNA或RNA作为3'端接头，因此可以大大降低连接反应的背景，通常是小RNA等建库时的优先选择。

T4 Rnl2tr连接时不需要ATP，但需要5'端预腺苷酰化(也称预腺苷化、腺苷酰化或腺苷化)底物。即使在有ATP存在的情况下，T4 Rnl2tr也不能催化连接单链DNA或RNA 5'-P末端与3'-OH末端之间形成磷酸二酯键。而T4 RNA Ligase I可以在ATP存在的情况下，催化连接单链DNA或RNA 5'-P末端与3'-OH末端之间形成磷酸二酯键。因此T4 Rnl2tr特别适用于small RNA library的制备，不管是进行miRNA的测序还是进行directional mRNA-Seq，该酶都可以提高建库的质量，并有效降低连接反应的背景。

• 5'末端预腺苷酰化的单链DNA或者RNA与单链RNA的3'羟基末端连接；
  
• cDNA文库构建中连接5'末端预腺苷酰化单链寡核苷酸和小RNA；
  
• 链特异性的cDNA文库构建中连接5'末端预腺苷酰化单链寡核苷酸和RNA；
  
• 二代测序中，miRNA文库构建中RNA的3'末端与接头之间的连接；
  
• cDNA文库的构建以进行小RNA转录组分析(small-RNA transcriptome analysis)。

大肠杆菌表达的重组蛋白，表达基因为T4嗜菌体T4 RNA连接酶II N端1-249位的氨基酸。


200单位是指10μL反应体积中，25℃条件下，1小时内将31-mer RNA的80%连接到17-mer DNA的预腺苷化端所需要的酶量。

组分	5kU	20kU	100kU
T4 Rnl2tr(200U/μL)	25μL	100μL	500μL
10×T4 Rnl2tr Buffer	75μL	300μL	1.5mL
PEG8000(50%,RNase-free)	400μL	1.5mL	7.5mL

保存：-20℃，有效期1年。


10mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，0.1mM EDTA，0.1mM DTT，50% (v/v) Glycerol。


65℃加热20min可使T4 Rnl2tr失活，或加入蛋白酶K或EDTA也可以抑制其活性。


无DNA内切酶和外切酶活性，无RNA酶活性，无蛋白酶活性。

• 本制品提供的试剂均用不含DNA酶和RNA酶的水配制，可直接用于3'端为羟基的单链RNA和5'端腺苷酰化的DNA或RNA之间的连接反应。
  
• 可根据具体应用选择合适的操作方法，可能需准备额外的试剂，如百奥莱博的RNase抑制剂、DEPC水等。
  
• 使用本制品连接ssRNA和AppDNA时，建议使用的PEG8000(货号：YTB0616)的浓度为10%～30%，适当提高PEG8000的浓度，会显著提高T4 Rnl2,truncated的催化的连接效率，而不改变其反应特性。

使用本制品催化连接AppDNA和ssRNA的效果请参见图1。

图1.本制品和国外N公司的同类产品催化连接AppDNA和ssRNA的效果图。使用本制品或竞品，在20μL反应体系中加入图中指定量的本制品或竞品，25℃孵育60min进行连接反应，反应完毕后立即取样在65℃孵育20min终止反应，加入变性上样缓冲液，在95℃孵育5min后放至冰浴中，随后用15%尿素(7M)变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析，最终进行核酸染色和荧光成像分析。如图所示，本制品与竞品相比，具有类似的催化效果。

• 用于连接5'端腺苷酰化并且3'端不是羟基的(例如为氨基)单链DNA (AppDNA-NH2)和3'端为羟基的单链RNA (ssRNA)的使用说明具体如下。需要提前准备好待连接的样品，以及Universal miRNA Cloning Linker或自备的适当接头。
  
• 参考下表在冰浴中配制如下反应体系：
  

  成分	组分	终浓度
  ssRNA	x μL	0.5 or 1μM
  DEPC-treated Water	(4-x-y)μL	-
  Universal miRNA Cloning Linker	y μL	1 or 0.5,or 2 or 1μM
  PEG8000 (50%,RNase-Free)	12μL	0.3
  10×T4 Rnl2tr Buffer	2μL	1×
  RNase Inhibitor(40U/μL)	1μL	2U/μL
  T4 Rnl2tr(200U/μL)	1μL	10U/μL
  总体积	20μL	-

  • 由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。推荐在连接体系中添加RNase Inhibitor，以避免ssRNA或其连接产物的降解，尽管经测试我们发现在严格操作的情况下，不加RNase Inhibitor也不会导致ssRNA或其连接产物发生明显降解。
    
  • 进行连接反应时，如果样品RNA比较珍贵，希望充分被连接，可以按照接头和样品RNA的摩尔比为2:1的比例进行连接；如果样品RNA比较充裕，同时感觉接头的成本偏高时，可以按照接头和样品RNA的摩尔比摩尔比1:1甚至1:2的比例进行连接反应，这样可以很好地节省接头。ssRNA的用量可以根据实际的样品量进行适当调节，相应的接头的用量也按照比例进行适当调整即可。
    
  • 如果同时进行多个连接反应，可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前预混合，然后再分装到各反应管内。
• 连接反应：25℃，孵育60min。为了使连接反应更加充分，可以适当延长连接反应时间。
  
• 终止反应：65℃，孵育20min。

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